Univerza v Ljubljani

Fakulteta za gradbeništvo in geodezijo

Oddelek za geodezijo-UNI

 

 

 

 

 

Seminarska naloga:

 

 

Elektroporacija

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


            Mentor:                                                                                              Avtorica:

            dr. Zvonko Jagličić                                                                            Vanja Aš

 

 

 

 

Novo mesto, maj 2003

 

1.     RAZVOJ ELEKTROPORACIJE DO DANES

 

V petdesetih in šestdesetih letih se je pojavila vrsta publikacij, ki so opisovale, da zunanje električno polje lahko vsili velik membranski potencial na obeh polih celice. Raziskovalci so vedeli, da lahko zelo veliko električno polje povzroči celično smrt. Sale in Hamilton sta s poskusi na različnih bakterijah in eritrocitih ugotovila, da lahko transmembranski potencial, ki doseže kritično vrednost, povzroči spremembe v strukturi membrane, katerih rezultat je izguba polprepustnosti. Kritično vrednost transmembranskega potenciala sta izračunala iz povprečnega premera celic in električne poljske jakosti, ki je povzročila uničenje 50 % celic v opazovani populaciji. Izračunane vrednosti vsiljene spremembe transmembranskega potenciala so se pri vseh opazovanih celicah vrtele okrog enega volta.

Proti koncu sedemdesetih so odkrili, da električno polje, ki ga dovedemo v obliki zelo kratkega pulza , sicer poruši polprepustno strukturo membrane, vendar celica lahko to popravi in vzpostavi prvotno stanje.

V začetku osemdesetih so se pojavila poročila, da lahko ob permeabilizaciji membrane v celico vstopijo različne majhne molekule, kot so ioni, barvila in sladkorji, kasneje pa tudi o vnosu različnih makromolekul, kot so DNA in zdravila.

 

2.     VPLIV ELEKTRIČNEGA POLJA NA CELICE

 

Homogeno električno polje deluje na nabite delce s silo, ki je sorazmerna električni poljski jakosti. Nenabite delce skuša električno polje deformirati. V nehomogenem električnem polju na nenabite delce deluje sila, ki povzroči njihovo gibanje. V električnem polju lahko torej pride do gibanja celic, celice zaradi prisotnosti električnega polja spremenijo obliko, se uredijo v verige in se v polju orientirajo. Pulzirajoče električno polje povzroči povezavo dveh ločenih membran v eno, zlitje celic poveča prepustnost celične membrane in membran celičnih organelov. Pojav povečanja prepustnosti celične membrane imenujemo elektroporacija oziroma elektropermeabilizacija, uporablja pa se za vnos različnih snovi v celice.

 

3.     ELEKTROPORACIJA – OPIS POJAVA

 

Elektroporacija je pojav, pri katerem zaradi prisotnosti že kratkotrajnega visokonapetostnega električnega pulza v celični membrani nastajajo strukturne spremembe, ki jih imenujemo »pore«. Ob zadostnem številu le-teh in njihovi ustrezni velikosti se poveča prepustnost plazmaleme (= celična membrana).

 

Plazmalemo tvori tanka, tekoča dvojna plast posebnih maščob, v kateri se nahajajo številne beljakovine, ki opravljajo najrazličnejše naloge. Med njimi so tudi takšne, ki skrbijo za prenos

snovi prek membrane. Vsaka od teh beljakovin omogoča le prenos ene same snovi, zato je plazmalema selektivno prepustna, kar celici omogoča, da nadzira izmenjavo snovi med svojo notranjostjo in okolico. S tem celica v svoji notranjosti vzdržuje sorazmerno stabilne pogoje ne glede na spremembe v okolici, snovi, ki jih v naravi ne zasledimo, pa praktično ne morejo vstopiti. Poleg izredno nizke prepustnosti za tuje molekule ima plazmalema tudi zelo nizko električno prevodnost tako v primerjavi z notranjostjo celice kot z njeno okolico. Če na celico deluje električno polje, se plazmalema obnaša kot izolator, na njej pa nastane t.i. vsiljena transmembranska napetost.

 

Zanimivo je, da kratkotrajna vsiljena transmembranska napetost (do nekaj sto milivoltov) ne povzroči opaznih posledic. Če pa ta napetost preseže neko kritično vrednost, ki znaša v različnih pogojih med 200 mV in 1 V, se prepustnost in prevodnost plazmaleme skorajda v trenutku močno povečata. Plazmalema začne takrat neselektivno prepuščati vse vrste molekul in ionov. Če amplituda in trajanje napetostnih pulzov nista prevelika, pride po končanem električnem pulzu do spontane zacelitve plazmaleme in ponovne vzpostavitve selektivne prepustnosti plazmaleme-reverzibilna/povratna elektroporacija. V kolikor pa uporabimo premočne ali predolge pulze, pa do zacelitve plazmaleme ne pride in celica odmre. V tem primeru govorimo o ireverzibilni/nepovratni elektroporaciji.        

 

Zaradi zunanjega električnega polja se transmembranski potencial spremeni v nekaj mi­krosekundah. Če je sprememba transmembranskega potenciala dovolj velika, se zaradi nje spremeni struktura membrane. Sprememba transmembranskega potenciala je premosorazmerna jakosti električnega polja in velikosti celice, ter je odvisna od polo­žaja na membrani. Čim bolj pravokotno tokovnice električnega polja prebadajo površi­no celice, tem večja je na tem mestu sprememba transmembranskega potenciala. Prepustnost celične membrane nastopi pri pragovni vrednosti transmembranskega po­tenciala. Pragovna vrednost transmembranske­ga potenciala pa znaša približno

1 V.

 

Strukturne spremembe v celični membrani, ki nastanejo v prisotnosti električnega po­Ija, so nekakšen tristopenjski proces. Pojavijo se ob pragovni transmembranski na­petosti, ki zahteva pragovno vrednost jakosti zunanjega električnega polja. Strukturne spremembe se med prisotnostjo zunanjega električnega polja večajo oziro­ma množijo. To so kratkotrajne spremembe v strukturi celične membrane. Ko zunanje električno polje izključimo, se lahko kratkotrajne strukturne spremembe preuredijo v os­novno stanje, ali pa v nekaj mikrosekundah zavzamejo stabilno konfiguracijo. Tako na­stale spremembe imenujemo dolgotrajne, saj se le počasi (tudi nekaj 10 minut) preuredijo v izhodiščno stanje (slika 1).

 


 


Slika 1. Shema por v membrani.

 

 

Povečanje prepustnosti membrane, ki ga povzroči električno polje, omogoča vstop v ce­lico različnim molekulam, od preprostih ionov do makromulekul. Kako bo molekula prišla v celico, pa je odvisno od njene velikosti, molekularne teže in naboja. Ko se prične povečevati prepustnost membrane, se vnos molekul povečuje z višanjem električne poljske jakosti in hitro doseže največjo vrednost (plato). Pri nizkih jakostih električnega polja je transport nadzorovan z nekim od električnega polja odvisnim procesom. Pri višjih električnih poljskih jakostih, to je tistih, pri ka­terih dosežemo plato vnosa molekul, pa transport ni več odvisen od jakosti električne­ga polja, saj lahko majhne molekule dodamo v celično okolico tudi po aplikaciji električnega polja; torej so za njihov vnos odločilne dolgotrajne spremembe v celični membrani, ki jih lahko pov­zročimo že s kratkimi električnimi pulzi. Makromolekule (protitelesa, encimi, nukleinske kisline, nekatera zdravila) pa vstopijo v ce­lico le v primeru, če so prisotne že med aplikacijo električnega polja; torej so za njihov vnos odločilne kratkotrajne spremembe v strukturi membrane. Makromo­lekule zato potrebujejo dlje trajajoče pulze ali večje število krajših pulzov. Koliko molekul bo med prisotnostjo električnega polja prišlo v celico, je odvisno od njihove molekularne teže; težjih molekul bo v celico vstopilo manj kot lažjih.

 

 

 

Višja je jakost električnega polja, več celic je elektroporiranih. Toda hkrati se povečuje tudi delež celic, ki jih močno električno polje uniči (slika 2). Kadar je jakost električne­ga polja zelo velika, elektroporacije ne preživi nobena celica.

 


 


Slika 2. Delež živih, flourescentnih in mrtvih celic v odvisnosti od napetosti. Celice so bile izpostavljene osmim pulzom dolžine 100ms ob prisotnosti propidijevega jodida.

 

 

3.1. DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA ELEKTROPORACIJO

 

Na elektroporacijo in povečanje prepustnosti celične membrane ter vnos eksogenih/zunanjih molekul vplivajo številni dejavniki:

 

Ø      električni parametri:   -    jakost električnega polja

-        trajanje pulza

-        število pulzov

-        frekvenca aplikacije pulzov

 

Ø      drugi dejavniki:     -   prevodnost medija

                                      -   ozmotski tlak

                                      -   popolnost celičnega skeleta

 

3.1.1. PARAMETRI ELEKTRIČNEGA POLJA

 

Elektroporacijo celice dosežemo tako, da damo celico v električno polje z ustrezno elek­trično poljsko jakostjo. Električna poljska jakost mora biti višja od pragovne in hkrati do­volj nizka, da plazmaleme ne poškoduje trajno.

 

Pri električni poljski jakosti, ki je višja ali enaka pragovni, tako povečanje števila pulzov (slika 3), kot tudi podaljšanje trajanja pulzov (slika 4) izboljša učinkovitost permeabili­zacije; seveda le do nekega platoja, ki ga dosežemo že pri relativno majhni vrednosti tako trajanja kot števila pulzov. Permeabilizacija je bolj učinkovita, če je čas med posameznimi pulzi krajši. Pri vseh teh parametrih pa so vrednosti omeje­ne z njihovim vplivom na preživetje celic. Vrednosti parametrov so odvisne od velikosti celice, njene oblike, orientacije, gostote celic ipd. in se tako od celice do celice razliku­jejo.

 


 


Slika 3. Odstotek permeabiliziranih celic v odvisnosti od števila pulzov. Dolžina enega pulza je bila 1ms, jakost električnega polja med posameznim pulzom pa 900V/cm.

 

 

Slika 4. Odstotek permeabiliziranih celic v odvisnosti od trajanja pulzov. Celice so bile izpostavljene 5 pulzom in električnemu polju 900V/cm.

 

 

3.1.2. DRUGI DEJAVNIKI

 

PREVODNOST MEDIJA

Vpliv električnega polja na površino membrane posredujejo ioni. Višja je koncentracija prostih ionov v mediju, učinkovitejša bo poracija. V nizkoprevodnih medijih se zmanjša vsiljeni transmembranski potencial. Za permeabilizacijo je zato potrebno električno polje višjih jakosti oziroma dlje trajajoči pulzi.

 

OZMOTSKI TLAK

Poskusi na celicah, ki rastejo v plasti pritrjene na dno posode, so pokazali, da ozmot­ski tlak močno vpliva na pragovno vrednost jakosti zunanjega električnega polja, ki je bistveno večja pri višjem ozmotskem tlaku. Nižji je ozmotski tlak, učinkovitejša je elektroper­meabilizacija; prej dosežemo plato elektropermeabilizacije. Na celice, ki jih porira­mo v suspenziji, ima ozmotski tlak podoben vpliv, le pragovna vrednost jakosti zunanjega električnega polja naj bi bila neodvisna od ozmotskega tlaka.

 

POPOLNOST CELIČNEGA SKELETA

Če poškodujemo celični skelet, bodisi kemično ali s temperaturnim šokom, postanejo tako imenovane dolgotrajne spremembe v strukturi membrane nestabilne. Posledica temperaturnega šoka je dvig praga električne poljske jakosti za elektroporacijo in nastanek le kratko trajajočih strukturnih sprememb v celični membrani.

 

4.     PODROČJA UPORABE ELEKTROPORACIJE

 

Membrana je neprepustna za določeno molekulo, če le-ta sama ne more skozi mem­brano, in je izključena iz vseh membranskih transportov. Permeabilizacija, povzročena z električnim poljem, ima nekaj prednosti pred drugimi biokemičnimi metodami:

• lahko jo uporabimo na vsaki celici,

 • ne prizadene celičnega preživetja,

• je specifična za plazmalemo in ne prizadene membran celičnih organelov,

• povzroči le minimalne motnje membranskih funkcij.

Opisane lastnosti so vzrok njeni široki uporabnosti. Z elektropermeabilizacijo vnašamo v ce­lice gene in zdravila. V celično membrano vstavljamo beljakovine. Z njeno pomočjo preu­čujemo aktivnosti encimov. S pomočjo električnih pulzov vnašamo v telo zdravila preko kože in antibiotike v krvne celice.

 

4.1. MOLEKULARNA GENETIKA

 

Kadar za vnos genskega materiala v celico uporabljamo postopek z visokonapetostni­mi električnimi pulzi, govorimo o elektrotransfekciji. Metodo uporabljamo v molekularni biologiji in genetiki, saj z njo lahko vnesemo DNA v vsako prokariontsko in evkariont­sko celico. Postopek je enostaven, ponovljiv in zelo učinkovit. V primerjavi z drugimi teh­nikami, ki so danes v uporabi za vnašanje genskega materiala v žive celice, elektrotransfekcija povzroči najmanj sprememb na ciljni celici in najmanj mutacij na gen­skem materialu. Z elektroporacijo lahko vnesemo v celico izredno velike molekule DNA, tudi desetkrat večje kot z drugimi metodami.

 

4.2. ELEKTROGENSKO ZDRAVLJENJE

 

Z genskim zdravljenjem mutirani gen, ki določa neko bolezensko stanje, zamenjamo z normalnim. Pri elektroporaciji se elektroporirani gen rekombinira s homolognimi gostiteljskimi geni. Celica ima novo obliko gena prav na mestu mutiranega gena, zato je metoda zelo zanesljiva.

 

4.3. ELEKTROKEMOTERAPIJA

 

Vnos zdravil v celice z elektroporacijo imenujemo elektrokemoterapija. Uporablja se za zdravljenje tumorjev. Elektroporacija namreč omogoča povečan vstop kemoterapevtikov v maligne celice in s tem posledično njihovo večje protitumorsko delovanje. Elektrokemoterapija tudi spodbudi delovanje imunskega sistema.

 

 

 


 


Slika 5. Elektrokemoterapija tumorja.

 A-molekule v veno vbrizganega zdravila obkrožijo tumorske celice.

B-pulz visoke napetosti povzroči nastanek por v celični membrani. Molekule zdravila vstopijo v celično notranjost.

C-pore se zaprejo. Molekule zdravila uničijo tumorske celic.

 

 

5.   KOMENTAR

 

Elektroporacija celic je sorazmerno nova metoda, ki se je hitro uveljavila v biokemičnih in celičnih laboratorijih, pričenjajo pa jo uporabljati tudi v medicinske namene. V onkologiji z elektroporacijo povečajo vnos nekaterih kemoterapevtikov in s tem povišajo učinkovitost zdravljenja raka (elektrokemoterapija tumorjev), v biotehnologiji jo uporabljajo za vnos DNK in s tem gensko spreminjanje celic, v zadnjem času pa skušajo z vnosom DNK v celice odpraviti tudi genske okvare (genska terapija).

 

 

 

6.     LITERATURA

 

¨      http://lbk.fe.uni-lj.si/

¨      http://www.medrazgl.org/

¨      http://medenosrce.ksmf.org/